Nature | 易基因DNA甲基化测序助力人多能干细胞向胚胎全能8细胞的人工诱导

北京时间2022年3月22日凌晨，《Nature》期刊在线刊登了由中国科学院广州生物医学与健康研究所等单位牵头，深圳市易基因科技有限公司、中国科学技术大学等单位参与，应用人多能干细胞向胚胎8细胞状态人工诱导的科研成果。深圳市易基因科技有限公司运用简化基因组甲基化测序、单细胞和微量细胞基因组DNA甲基化测序等技术，完成了研究中不同人工干预及细胞状态下的基因组DNA甲基化的时空动态变化。

研究者进一步观察4CL中TSA和DZNep剂量的增加对原始多能干细胞的影响。结果发现， 5天后，这种增强的4CL培养基(e4CL)促进了TPRX1、ZSCAN4、ZSCAN5B、DUXA/B和ZNF280A等全能性基因的表达，这些基因在不同的原始培养基中，在PSC细胞中表达量较低，尤其是在扩展多能干细胞中(expanded pluripotent stem cells, EPSC).在e4CL培养基中，细胞的核型保持正常，但不能传代进行扩增培养，这可能与全能性细胞缺乏自我更新能力有关。 始发态细胞在e4CL中直接培养7天也可以激活全能性基因(图1)，这种方法称为直接e4CL（direct e4CL），以区别于阶梯式的，首先是4CL，然后是e4CL转化(阶梯式e4CL)。

DNA甲基化是基因表达的重要调控因子，在早期胚胎发育、始发态向原始态多能干细胞转化过程中，DNA甲基化将发生显著动态改变。已有研究报道，人工诱导过程DNA大范围的去甲基化与基因组稳定性的风险增加密切相关。研究者通过与胚胎发育8细胞DNA甲基化对比，探究e4CL培养基用于8CLC细胞转化过程中，原始多能和全能性基因的甲基化变化情况。

首先，对始发态PSC、4CL 12天培养的原始态PSC和进一步e4CL 5天培养，以及直接e4CL 7天培养的细胞进行简化基因组甲基化测序。结果显示4CL 12天培养的原始态PSC甲基化水平比始发态PSC甲基化水平更低（图2a），且与各种已发表的诱导技术相比，4CL 12天培养的原始态PSC基因组印迹位点与胚胎内细胞团 (ICM) 相似性程度更高（图2b） 。直接e4CL 7天培养细胞甲基化水平与胚胎8细胞甲基化水平相似（图2a）。

无论是简化基因组甲基化测序结果还是微量细胞全基因组甲基化测序，原始多潜能基因和全能基因甲基化水平都保持相对一致水平(图4)。

为进一步探索8CLC细胞形成分子机制，研究者分析了不同细胞状态的基因表达差异，发现449个基因表达在8CLC中上调，几乎无下调基因。其中DPPA3和TPRX1基因处于上调前五基因内。已知DPPA3与UHRF1及DNMT1作用，控制小鼠卵母细胞被动去甲基化过程。DPPA3也通过调控印记基因甲基化修饰，参与到小鼠体细胞重编程过程。作者敲除DPPA3基因阻断了始发态PSC细胞向原始态PSC细胞的转化。敲除TPRX1基因阻断了阶段式e4CL和直接e4CL诱导8细胞胚胎标志物的形成，但是对4CL 12天培养原始态PSC的形成影响不大。与上述结果相对应，DPPA3基因敲除后，4CL 12天和e4CL 直接7天细胞基因组DNA甲基化整体升高（图5a）。DPPA5和KHDC3L等原始多潜能基因，以及TPRX1和TRIM43等全能基因转录起始位点区域DNA甲基化在DPPA3敲除后都升高（图5b-d）。DPPA3敲除后，基因间区DNA甲基化同样升高（图5e），提示其作为远端调节区域和3D染色质相互作用的潜在位点 。表明8CLC转化过程中细胞功能和基因调控网络的重组发生了重大变化。

论文的通讯作者，中国科学院Miguel A. Esteban教授、Md. Abdul Mazid博士和李文娟博士表示：“这些全能性的8细胞期胚胎样细胞重建了受精卵仅分裂3次后的胚胎状态，相比过去的多能干细胞，这种细胞可以分化为胎盘组织，并可能发育为更成熟的各类身体组织，为全世界数百万需要进行器官移植的患者带来了福音。”

深圳市易基因科技有限公司联合创始人，也是项目主要参与者王君文博士表示：“表观遗传特别是DNA甲基化调控在胚胎发育过程中发挥重要的作用。哺乳动物受精后，精子首先经历一个快速去甲基化过程。随后，卵子来源基因组DNA在2细胞到8细胞发育期间进一步去甲基化，直到桑葚胚，整个受精卵基本完成甲基化去除。在随后的约囊胚期，整个受精卵在DNA甲基化转移酶DNMT3A和DNMT3B等一系列酶控作用下，精确完成DNA甲基化的重编程，调控细胞的定向发育。”