实力or噱头？这家公司称新推出的测序产品将使产出提高三倍

单细胞测序网讯：近日，牛津纳米孔技术公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）表示将在今年第三季度推出一种新的直接RNA测序试剂，将大大提高单分子原始读长的准确性，且产出提高3-4倍。

牛津纳米孔技术公司的DNA应用产品一直以来更新迭代的速度相对较快，但此次带来的RNA套件更新似乎是ONT近几年来对其RNA测序化学产品的第一次大调整。据牛津纳米孔负责RNA测序的首席科学家Libby Snell介绍，新的RNA测序试剂盒Sqk-RNA004在某种程度上是对目前RNA002试剂盒的跳代更新，它最初是在2018年左右发布的。

"我们一度在研究名为RNA003的化学试剂，但我们对实际发布它不太放心，所以我们退了一步，重新评估，并开始研究一种不同的化学成分，也就是RNA004。"Snell在公司年度用户会议上告诉与会者。

Snell表示，与目前利用与DNA测序相同的孔隙的RNA试剂盒不同，新化学试剂盒的一个关键特征是它采用了一种名为RP4的RNA测序专用孔隙。这意味着新试剂盒将需要与DNA测序不同的流动细胞。

此外，新的RNA化学试剂将配备一个更快的马达，以每秒约120个碱基的速度转移RNA分子，而更新前的速度是每秒70个碱基。Snell称，有了这种数据输出，RNA测序运行后每个PromethIon流动池可以提供多达约3000万个读数。更新后的化学产品还有望通过纳入更大的神经网络和扩大训练数据集来提高原始读数的准确性。Snell说：“RNA004有望达到人类转录组约96%的单读准确率，与目前的版本相比是 ‘一个重大改进’。”

在样本准备方面，RNA004试剂盒将有一个与RNA002 "非常相似 "的程序，即工作流程都是从3'连接开始，然后是中间的反转录步骤，以生成一个DNA-RNA杂交分子。不过逆转录产品只是提供一个支架，帮助本地RNA分子通过孔隙转移，cDNA链不会通过孔隙或被测序仪读取。

至于输入要求，Snell表示新的化学方法需要100纳克到200纳克的富集RNA或1微克的总RNA作为起始材料。她补充说："你可以有更低的投入，只是必须明白你将得到更少的产出。”

目前RNA004试剂盒的公开数据仍然很少，不过Snell透露了一些内部的基准测试结果。她表示，当用定量RNA转录板测试时，RNA004在目标RNA分子的预期与观察浓度之间显示出 "真正的高相关性"。此外，她指出，用RNA002和RNA004试剂盒测序的样本之间有 "非常好的相关性"，而且新的化学试剂在技术重复中显示出一致的数据质量。

加拿大Sainte-Justine大学医院研究中心的计算生物学家Martin Smith是RNA004试剂盒的早期用户之一，他的团队专注于研究长非编码RNAs，大约三周前才收到新的RNA流动细胞，在一次会议发言中他分享了对这种新产品的初步印象。

他们首先用商业化的多A富集RNA测试了新的化学方法，在PromethIon流动池上产生了接近1500万个读数；当应用于总RNA时，该试剂盒产生了大约1400万读数。Smith表示他对这些结果印象深刻，并补充说："这就是我们所期待的更新。”他指出，多聚物-A富集的RNA往往会使读取长度下降一点，这可能是由于多聚物-A选择程序需要额外的操作步骤。在数据质量方面，该小组达到了95%到96%的单碱基准确度。史密斯表示，虽然已知的同源物问题在新的化学试剂中仍然存在，但他相信这些问题可以通过原始信号分析来解决。

在最初的基准测试之后，史密斯和他的团队使用了20个RNA004 PromethIon流动细胞进行功能性癌症基因组学分析。具体来说，他的团队从Nalm6细胞中生成了原生转录组，并对通过CRISPR-Cas9筛选确定的四种癌症相关长非编码RNA进行CRISPR-Cas13敲除。总的来说，新的试剂盒能够帮助识别样本中新的RNA异构体和新的长非编码RNAs。

巴塞罗那基因组调控中心的组长、纳米孔RNA测序专家Eva Maria Novoa在一封电子邮件中说："我认为新试剂盒的主要改进是提高了通量，这是一个非常好的功能。”Novoa表示，她的小组最近发表了一种用于纳米孔测序tRNA的新方法，还没有尝试过新的RNA套件。然而，根据ONT公司介绍的情况以及与一些早期用户的个人互动，她认为牛津纳米孔承诺的产量增加三到四倍可能 "过于乐观"。

尽管如此，她认为测序产量的提高将使研究人员能够探索更广泛的转录本，而且每个转录本覆盖率的提高也能提高统计能力，帮助研究人员通过差异表达分析识别失调的转录本。

虽然Novoa认为RNA004的准确度提高 "非常好"，但她也指出，现有的化学方法已经可以通过改进的基点模型达到这一准确度。例如，她的研究小组已经使用RNA002化学试剂和内部培训的基点呼叫器实现了96%到97%的原始读取准确率。此外，Novoa还指出，新的化学方法在检测RNA修饰方面是好是坏还有待观察，这对RNA研究很重要。由于新的化学方法涉及到一个新的孔，研究人员不得不重新训练他们现有的RNA修饰的基线模型。

牛津纳米孔的专有测序数据分析MinKnow现在仍不能直接调用RNA修饰，该公司表示，这一功能将在 "适当的时候 "开发。

在一次单独的技术更新演讲中，牛津纳米孔的首席技术、创新和产品官Clive Brown指出了调用RNA修饰的挑战，其中至少有170种不同类型。

Brown说："RNA通常有相当多的修改，因此，我们遇到了与DNA相同的问题，且更糟糕。"他补充到，公司的研究人员已经确定了少量的RNA修饰作为起点，并且正在合成已知位置上有修饰的RNA文库，以帮助训练基数测定软件。

除了RNA测序，Brown还提供了ONT公司研发管道的最新情况，包括具有iPad连接性的新MinIon模型和新的特定应用集成电路（ASIC）芯片，将用于支持一个新的低成本、低功耗设备系列。

据牛津纳米孔公司产品与项目管理高级副总裁Rosemary Sinclair Dokos介绍，RNA004试剂盒目前可用于开发访问，将在今年夏天随着公司扩大试剂盒的生产规模而提前准入。

参考资料：

Oxford Nanopore Technologies Unveils New Direct RNA Sequencing Chemistry | GenomeWeb

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