Cell丨曹俊越团队开发单细胞组学新方法—TrackerSci，揭示衰老和阿尔茨海默症祖细胞类型及表观遗传特征

发表时间：2023-10-08 12:25

导语

祖细胞 (progenitor cells) 在维持机体内稳态方面起着关键作用，然而在衰老过程中它们的多样性和动态性仍然未被充分探索。

单细胞测序网讯：2023年9月28日，美国洛克菲勒大学曹俊越课题组在Cell在线发表文章 Tracking cell-type-specific temporal dynamics in human and mouse brains 。共同第一作者为洛克菲勒大学在读博士生卢梓育和科研助理Melissa Zhang。他们结合新生细胞标记和组合索引单细胞测序技术 (single-cell combinatorial indexing)，开发了一项单细胞组学新方法TrackerSci，用于表征体内增殖祖细胞的转录组和开放染色质组。使用TrackerSci，作者研究了不同年龄阶段和阿尔茨海默病模型小鼠的全脑新生细胞，揭示了多样的祖细胞类型及其表观遗传特征，量化了与衰老相关的细胞类型特异性增殖和分化的变化动态，并鉴定衰老相关调控基因。此外，作者扩展至老年人脑，研究了祖细胞跨物种间的保守特征，并分析了脑区特定的细胞分化动态。

新的神经元和胶质细胞不断地在成年哺乳动物的大脑中产生，这是与记忆、学习和应激相关的重要过程。该过程的受损与衰老和神经病理疾病的发展紧密联系。因此，捕获、追踪并鉴定新生细胞的方法对于理解细胞群体稳态的维持，以及在衰老、疾病状态下的群体动态变化至关重要。然而，研究稀有的成脑细胞新生事件受到现有技术的限制。首先，多数研究依赖于少数已知的蛋白标记物，可能在定量组织中极少见的祖细胞时引入偏差。其次，祖细胞是通过严格控制的表观遗传程序定义的，而前人研究多关注于基因表达特征，但对其表观遗传谱以及在衰老过程中改变的理解仍相对有限。此外，尽管基因组学的进步推动了单细胞水平上的基因表达和表观遗传图谱的探索，但对成年或老年大脑中的单细胞分析主要集中在最常见的细胞类型如成熟神经元上，不适宜精确地表征罕见的细胞新生过程。基于此，作者开发了TrackerSci，针对成脑新生细胞进行了单细胞转录组或染色质可及性谱的分析，并研究了衰老过程中新生细胞增殖和分化的变化。

TrackerSci方法基于此前曹俊越及同事开发的组合索引单细胞测序平台。首先，通过对小鼠注射EdU标记增殖细胞，并进行细胞分选以富集EdU阳性细胞且分配至96孔板。随后，在逆转录或Tn5转座酶切割的同时为细胞内的RNA或DNA引入第一轮标记。紧接着，所有细胞被混合，然后重新进行分选分配至96孔板，以进一步纯化EdU阳性细胞且引入第二轮标记。然后，作者或遵循sci-RNA-seq进行转录组分析，或使用sci-ATAC-seq进行染色质可及性分析。通过优化实验条件，作者证明了新生细胞标记和单细胞组合索引测序平台的兼容性，确保了流程对细胞分子状态的最小影响。

作者应用TrackerSci，对不同年龄阶段和阿尔茨海默病模型小鼠，进行了全脑范围的新生细胞捕获。作者观察到EdU阳性细胞群体富集了各类祖细胞或未成熟前体细胞，如神经祖细胞（neuronal progenitor cells），嗅球神经母细胞（olfactory bulb neuroblasts），齿状回神经母细胞（dentate gyrus neuroblasts) 和少突胶质细胞祖细胞（oligodendrocyte progenitor cells)。这与用传统方法捕捉到的以成熟神经元和成熟少突胶质细胞为主导的细胞组成显著不同。进一步的，通过整合TrackerSci数据集与曹俊越课题组最新开发的EasySci全脑细胞图谱数据集，作者观察到来自TrackerSci的中间态细胞连接了全脑细胞图谱数据集中多个终末分化的细胞类型。这验证了TrackerSci对新生细胞标记和的特异性，富集的必要性，突显了改方法在重建成体组织中连续细胞分化轨迹的应用。

其次，作者通过差异表达和差异可及性分析，着力于鉴定区分不同新生细胞类型的基因表达特征，表观遗传特征和转录调控因子。在基因表达层面，作者确定了两个高特异性的神经祖细胞的潜在标记物，Tead2和Esco2，且通过空间转录组数据进行验证。在表观遗传特征层面，通过基因和开放染色质位点的关联分析，作者鉴定了基因表达谱背后潜在的顺式调控元件网络。进一步的，作者整合入转录因子的结合序列信息，鉴定了细胞命运决定的潜在调控因子，例如在未成熟神经元中富集的Pou6f1和Hmbox1。

接下来，作者量化比较了年轻、成年和老年小鼠全脑中各类细胞的增殖率变化。不同细胞类型间呈现出高度异质的衰老反应。例如，相对于成年大脑，海马齿状回神经母细胞的增殖在老年大脑中减少了18倍，而血管内皮细胞的增殖只受到轻微影响。相比之下，疾病相关小胶质细胞 （dissease asscoicated microglia) 等免疫相关细胞的分裂在衰老小鼠中表现出显著的提升，而这也在阿尔茨海默病模型小鼠中得到发现。这可能与衰老和阿尔茨海默病过程中共同的炎症信号升高相关。细胞类型特异性的增殖变化在的EasySci全脑细胞图谱中得到了验证。

随后，作者考察了成脑中细胞分化过程的基因表达动态，开放染色质动态和转录因子动态，并研究了衰老对细胞分化不同阶段的影响。在神经元分化轨迹中，神经祖细胞阶段的下降在衰老中占据主导。而在少突胶质细胞分化轨迹中，少突胶质前体细胞（committed oligodendrocyte precursors) 的下降最为显著，而祖细胞阶段的影响相对较小。进一步，作者分析了衰老过程中神经祖细胞和少突胶质祖细胞的基因表达差异，鉴定了可能导致神经祖细胞分裂枯竭和少突胶质祖细胞分化受损的调控机制。例如，神经发生相关因子Nrg1, Nrg3, Nr2f1在神经祖细胞中的表达下降，和神经鞘磷脂合成相关基因Sgms1,Smpd4在少突胶质祖细胞的表达失调。通过分析一个对体外培养的原代神经干细胞进行全基因组CRISPR扰动并检测其分裂能力的数据集，作者验证了一部分影响神经祖细胞分裂的衰老相关基因。

最后，作者展示了TrackerSci数据集协助检测人脑中增殖或分化细胞的潜力。通过对来自老年人脑五个解剖区域的近80万个单核转录组进行分析，并与TrackerSci数据集整合，作者在老年人脑中检测到了罕见的分裂中或分化中细胞，并观察到少突胶质细胞生成过程中物种间保守或差异的特征。另外，作者发现相对于其他脑区域，小脑中少突胶质祖细胞分化减少，并揭示了其区域特异的基因控制机制。除此之外，作者整合分析了已发表数据，在成年人海马中识别到一个罕见的与小鼠海马齿状回母细胞类似的未成熟神经元群体，并在阿尔茨海默病人人脑中检测到了增殖小胶质细胞比例的提高。

综上所述，本文建立了研究细胞新生的新方法TrackerSci，分析了成脑中罕见的新生细胞群体，对衰老过程中细胞增殖和分裂的变化进行了探索，鉴定了潜在的靶向基因。期待未来该方法能助力全面了解衰老过程中细胞更替动态变化的分子程序，从而为患有与衰老相关疾病的患者恢复组织稳态提供帮助。