追踪疾病遗传原因的一种行之有效的方法是敲除动物体内的单个基因，并研究其对生物体的影响。问题是，许多疾病的病理变化是由多个基因决定的。这使得科学家们极难确定其中任何一个基因在多大程度上与疾病有关。要做到这一点，他们必须进行许多动物实验——每一种所需的基因修饰都要进行一次实验，这无疑给研究带来了巨大困难。科学界亟需新的方法来以高通量方式研究复杂组织中的基因型-表型关系。
单细胞测序网讯：9月20日，由巴塞尔苏黎世联邦理工学院生物系统科学与工程系生物工程教授Randall Platt领导的研究小组在Nature杂志以“Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq”为题发表了一篇研究论文，开发出了一种腺相关病毒（AAV）介导的直接体内单细胞CRISPR筛选方法，称为AAV-Perturb-seq，这是一种可调整且广泛适用的方法，可用于转录关联分析以及体内遗传扰动的高通量和高分辨率表型分析。利用 CRISPR-Cas 基因剪刀，研究人员可以在同一动物的单细胞水平上直接检测多种细胞类型中多个基因，而不受组织或发育时间点的限制。每个细胞中改变的基因不超过一个，但一个器官中的不同细胞会以不同的方式发生改变，从而实现对单个细胞进行精确分析。这样，研究人员就能在一次实验中研究多种不同基因变化的影响，大大简化和加快了实验动物的研究。为了正确指引小鼠细胞CRISPR-Cas基因剪刀应该破坏哪些基因，研究人员使用了腺相关病毒（AAV），他们使每个病毒粒子都携带破坏特定基因的信息，然后用携带不同基因破坏指令的混合病毒感染小鼠。这样，他们就能敲除一个器官不同细胞中的不同基因。通过AAV.PHP.B的全身给药和5′gRNA捕获，在大脑中进行体内单核汇集CRISPR筛选。利用 AAV-Perturb-seq 基因编辑和转录抑制技术，研究人员研究了一种罕见人类遗传疾病——22q11.2缺失综合征，系统地剖析了成年小鼠大脑前额叶皮层 22q11.2 缺失综合征的基因-表型图谱。22q11.2缺失综合征是由于22 号染色体缺失导致，每 4000 个新生儿中就有一个会受到影响，通常会导致心脏问题、免疫缺陷和认知问题等症状。患者通常被诊断为精神分裂症和自闭症谱系障碍等其他疾病。在此之前，人们知道这种疾病是由一个包含 106 个基因的染色体区域引起的，这种疾病与多种基因有关，但不知道哪些基因在疾病中起作用。
研究人员首先创建了一个AAV引导RNA（gRNA）文库，重点研究位于人类22q11.2基因座内、在小鼠基因组中保守的基因。他们确定了在成年小鼠皮层中表达的 29 个基因，并为其设计了 gRNA 序列。接下来，他们将含有 gRNA 的重组 AAV 注射到 LSL-Cas9 小鼠体内，或对 dCas9-KRAB 小鼠进行转录抑制，并在三周后收集大脑样本。对从不同细胞中分离出的细胞核进行聚类分析，结果显示AAV感染了神经元和非神经元脑细胞。研究结果表明，DGCR8、DGCR14、GNB1L 和 UFD1L 基因的扰动解释了在 22q11.2 缺失小鼠模型中观察到的约 40% 的转录变化。 
扰动与 22q11.2 相关的基因 Dgcr8、Dgcr14、Gnb1l 和 Ufd1l 会导致成人脑细胞类型发生强烈的转录变化。虽然人们对每个基因在成熟脑细胞中的功能知之甚少，也从未对其进行过系统研究，但研究人员发现，DGCR14 和 GNB1L 之间与 22q11.2DS 病理学相关。在此之前，DGCR8已被报道，而DGCR14 和 GNB1L 则不是科学界关注的焦点。研究结果表明，DGCR8、DGCR14 和 GNB1L 可能通过广泛改变体内与疾病易感性相关基因的表达，并通过一种涉及成熟神经元中 RNA 调节的机制，对 22q11.2DS 起作用。研究人员下一步将确定在发育期间或之后恢复DGCR8、DGCR14、GNB1L和UFD1L的表达是否能挽救22q11.2DS相关的神经元和认知表型。
22q11.2基因的扰动导致不同生物过程的破坏。
Randall Platt研究小组的博士生、本研究的第一作者António Santinha说："如果我们知道某种疾病的哪些基因有异常活动，我们就可以尝试开发补救这种异常的药物。”这种方法也适用于研究其他遗传疾病。Santinha说：“许多先天性疾病由多个基因共同起作用，如精神分裂症等精神疾病。现在，我们的技术可以让我们直接在完全生长的动物体内研究这类疾病及其遗传原因。随着技术不断完善，每次实验修改的基因数量可以从目前的 29 个增加到几百个。我们现在可以在活体生物中进行这些分析，这是一个很大的优势，因为细胞在培养过程中的行为与它们作为活体的一部分的行为是不同的。另一个优势是，科学家只需将 AAV 注射到动物的血液中即可，AAV有多种不同的功能特性，可以根据研究的内容进行制备。”苏黎世联邦理工学院已经为这项技术申请了专利，相关产品或将进行商业化。
参考资料：
https://www.nature.com/articles/s41586-023-06570-y
https://www.eurekalert.org/news-releases/1001848
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