近年来，单细胞测序技术已经被广泛应用到生命科学的各个领域，在发育生物学、神经生物学、癌症生物学等皆有应用。除此之外，单细胞测序技术还被广泛运用到药物的研发和筛选。越来越多生命科学领域的专家、学者投身于这一研究热点，这个技术也非常有希望能够解决人类生物医学中至今还没有解决的一些问题。
先天性心脏病是医学的一大难题，或许单细胞测序技术会是解开先天性心脏病的致病机理及其靶向位点的奥秘的关键钥匙。近日，《时空对话》栏目有幸邀请到南方医科大学发育生物学博士生导师艾珊珊教授，分享她在单细胞测序技术领域的研究成果及她开发的单细胞技术在先天性心脏病领域的转化应用。
南方医科大学 艾珊珊
艾珊珊，博士生导师。开发并利用单细胞多组学技术解析心脏发育及再生过程中细胞命运决定及转变的表观分子调控机制。2020年于北京大学获博士学位。2020年加入南方医科大学生理学教研室。以共同第一作者身份在Nature Cell Biology, Molecular Cell, Elife, Circulation Research等SCI期刊发表5篇原创性论文。开发了两种具有普适性的单细胞ChIP-seq技术，分别命名为itChIP-seq (indexing and tagmentation-based ChIP-seq)和CoBATCH (combinatorial barcoding and targeted chromatin release)。参与发明专利3项，承担2项国自然科学基金，参与一项国家重点研发计划项目。 
请问您团队目前的研究方向是什么？取得了哪些成果或进展？
艾珊珊教授：我们团队目前主要的研究方向是聚焦于开发新的单细胞多组学技术，用此技术去解析心血管疾病中一些致病的分子机制，这个内容又可以分为两个大的方向。
一个是关注开发新的单细胞多组学技术。基于前期开发单细胞ChIP-seq技术的研究背景，我们目前主要开发以ChIP-seq为中心的单细胞多组学技术。由于多组学技术无论从操作上还是成本上都比较昂贵，我们拟进一步提高以ChIP-seq为中心的多组学技术的经济性与普适性，以便将这一技术向大部分实验室普及。技术上，我们也正在尝试将单细胞多组学技术与CRISPR系统进行结合，以便解析发育过程中基因表达调控的互作机制。
在生物学问题方面，我们关注利用单细胞多组学技术解析心血管疾病（包括先天性心脏病）的致病机制，同时探索促进心脏再生的分子机制与治疗靶点。我们试图利用单细胞技术深入解析人和小鼠心脏的正常发育过程，并结合疾病状态下细胞类型与分子调控机制的改变，阐明心血管疾病的致病机理及其潜在的分子靶点。关注心肌细胞与非心肌细胞的互作在发育和疾病过程中的细胞及分子生物学功能。
您参与开发了两项单细胞ChIP-seq技术（itChIP-seq和CoBATCH），能分别介绍一下这两项技术及其应用吗？
艾珊珊教授：这两项单细胞技术，分别运用不同的原理在单细胞水平对不同通量的细胞去实现捕获蛋白质与DNA之间相互作用的信息。简单来说，单细胞itCHIP-seq是利用Tn5转座酶替代传统超声将染色质打断，在打断的同时，给染色质带上一个独特的标签，然后将标签好的不同单细胞染色质合并到一起，进行传统的免疫共沉淀。最后利用测序数据去解析单细胞的分子标签，用来识别不同细胞的测序信息。
CoBATCH的技术原理最主要是利用ProteinA-Tn5融合蛋白，对目的蛋白结合的DNA序列进行靶向切割，切割完成后进行原管建库。同时CoBATCH技术引入了两轮分子标签组合，以实现高通量单细胞水平的捕获。所以从原理上来说，CoBATCH技术适合起始细胞数目较大量，需要捕获的细胞数目较多的样品。相比之下，itChIP-seq技术的起始细胞数目量仅为几百个。目前，我们正在开发可以替代单细胞itChIP-seq技术的具有更高捕获效率的新方法。
您以第一作者在Nature cell biology上发了“使用单细胞 itChIP-seq 分析染色质状态”这一论文，请您谈谈在研究过程中遇到了哪些难题，您和团队成员又是怎么解决的呢？
艾珊珊教授：单细胞itCHIP-seq的原理相对比较简单，即利用Tn5转座酶替代传统物理超声将染色质打断。但是我们在将这个简单的原理从理论变成现实的过程中确实遇到了很多问题。首先Tn5转座酶对开放的染色质具有天然的偏好性，被用来做ATAC-seq。
我们试想如果Tn5能够在基因组上进行均匀切割，理论上它对染色质的任意区域的可接近程度是一致的。
如何让Tn5在基因组上能够畅通无阻地进行无偏差地均匀切割，达到传统超声介导的切割效果？这是我们在开发这个技术的过程中遇到最大的一个问题。为了解决这个问题，我们进行了很多不同条件的尝试，最终确定将细胞用甲醛进行简单的交联后，利用SDS和高温处理细胞将其染色质变松散，由于提前进行了交联，染色质全面打开后并不会影响蛋白质与DNA的互作，由此是实现了Tn5的均匀切割。
虽然在技术开发的过程中对实验条件的摸索是一个非常细致、繁琐的过程，面临许多挑战，但也伴随很多乐趣。专注技术开发的科研人员需要很强的心理承受能力，因为在摸索实验条件的时候，需要从头进行优化，且有时候一个实验结果极可能推翻前面大量已证实的结果条件，一切从头再来，所以这个过程需要极大的毅力和心理承受能力。
您谈到在摸索的过程中其实有非常多的乐趣，能分享一下吗？
艾珊珊教授：这个乐趣体现在：当一个问题你查不到相关的参考文献能进行解答，为此你需要自己做出一个假设，然后你会设计很多不同的实验条件去验证这些假设，这个过程需要很大的工作量，你需要对每一个条件进行探索，而且是一个条件探索完了以后才能接着去探索另外一个，一步一步的推进，就好像你在给自己设置一个个关卡，然后一直不断地征服这一个个困难。当你成功了之后，你会非常开心，很有成就感。有时也会出现一些意想不到的实验结果，非常让人惊喜，很多时候是我们之前从来没预想过的，其实这也是在丰富我们自身知识储备的一个过程。
您去年和北大何爱彬教授曾在协和医学杂志发表《先天性心脏病基础研究进展》这一论文，谈及CHD领域目前尚存在诸多待解决的问题，您认为单细胞测序技术在解决这些问题过程中将发挥哪些作用？
艾珊珊教授：这是一个很好的问题，也是我们实验室现在正在关注的一个研究方向。心脏是体内最早形成的一个器官，它的发育是非常复杂的一个过程。这篇综述文章也有提到，先天性心脏病的致病机制非常复杂，包括遗传和非遗传因素。从单细胞的角度去解析心脏正常发育过程中不同细胞类型及其功能，能够揭示一些新的基因调控机制。
此外，如果将正常发育以及疾病状态下细胞类型进行比较，将能直接靶向受损的特定细胞类型并鉴定关键调控基因。虽然现在全基因组关联分析已经鉴定了许多先天性心脏病相关的遗传变异位点，但是大部分突变位点定位在基因组的非编码区域，这些非编码区域目前还缺乏非常完善的功能性注释信息。
如果我们利用单细胞多组学技术捕获心脏中不同类型细胞的染色质状态，建立染色质状态与基因表达的复杂调控网络，对非编码区的元件进行功能注释，这些注释信息，将有利于阐明与先天性心脏病相关的GWAS位点是否为致病风险位点，及其致病的细胞学及表观遗传学调控机制。相信这些理论基础将会为先天性心脏病的治疗提供非常丰富的一个实践基础。
请您谈一谈单细胞测序技术在发育生物学领域的应用，以及应用过程中面临的挑战。
艾珊珊教授：我觉得发育生物学中有三个非常基本的生物学问题，第一个是在一个完整的生命系统中，不同细胞如何在特定时期进行特定的分化？第二个是在这样一个复杂的系统，不同的细胞组织之间是如何协调相互作用去发挥功能？第三个是这些复杂的过程是受哪些基因表达调控的？这些简单基础的发育生物学问题，涉及复杂的基因表达调控，因此很难利用传统的生物学方法对其进行系统解析。而单细胞技术的出现，为解析这些复杂的生命过程的奥秘开辟了一个新的视角。首先，单细胞技术解决了细胞异质性的问题，可以将原来掩盖在大量细胞中的一些非常稀少的细胞群体以及一些较低丰度的重要调控信息展现出来。举例而言，我们可以利用单细胞测序技术鉴定不同发育过程中细胞类型的组成，明确细胞的异质性，鉴定不同类型细胞间的互作关系，描绘细胞发育过程中的分化轨迹，预测细胞分化的命运。甚至我们可以利用单细胞表观测序技术检测在特定分化谱系中细胞命运的预先决定的状态。
现在也有很多将单细胞技术与CRISPR技术结合，实现在任何发育系统中对细胞的分化轨迹进行谱系示踪，无偏差地构建细胞发育轨迹以及细胞命运的特化过程。同时，如果我们将单细胞测序技术与CRISPR结合，也能够高通量解析特定发育状态下不同基因的调控功能以及基因表达的复杂调控网络，从全局水平去解析不同基因的调控功能以及基因间复杂的互作关系。
尽管单细胞测序领域具有广泛的应用前景，但同时也面临着很多的挑战。首先，捕获的单细胞信息的稀疏性是单细胞测序技术的一个共性问题，稀疏的数据一方面增加了数据分析的难度，另外可能掩盖一些重要的生物学信息。虽然科学家们进行了诸多尝试，但效果依然不太理想。
还有一个就是单细胞测序的费用问题，特别是需要依赖商业化的测序平台的时候，大部分实验室没办法大量开展相关实验。很多单细胞多组学的测序目前仅部分实验室能开展，因此，技术的普及程度也是该领域的一个问题。我们也期待单细胞测序技术能尽快走进大部分实验室。
最后数据分析也是该领域目前存在的一个挑战。数据分析的挑战表现在两个方面，一个是目前开发的大量单细胞的数据分析的算法大多仅适用于细胞数目有限的情况，细胞数目大时，计算机运行速度大大降低。因此开发更为高效的数据分析方法迫在眉睫；另一方面，整合不同实验室的单细胞数据也存在一定的挑战，不同实验室可能采用不同的单细胞策略进行文库构建，并文库进行了不同深度的测序，数据质量参差不齐的情况下，如何将数据进行整合为自己所用也是一大问题。
您如何看待单细胞测序技术？您认为单细胞测序技术的未来发展前景如何？
艾珊珊教授：新技术是推动生物学领域发展的基石。针对技术本身而言，单细胞测序技术当然非常重要，我们能看到近几年来单细胞的技术已经被运用到生命科学的各个领域，不仅包括发育生物学、神经生物学甚至在癌症生物学也有应用。除此之外，单细胞测序技术还被广泛运用到药物的研发和筛选的平台。这一技术有望解决人类生物医学中尚未解决的关键问题。
就单细胞技术的发展而言，我认为单细胞测序技术目前仍在起步阶段，还有很多问题和挑战需要去解决和优化。其应用的广泛性决定其未来广泛的应用前景。例如，随着医学及计算科学的不断进步，精准医疗成为未来医疗发展的必然趋势，而单细胞测序的高分辨率将一定能为精准医疗的推进提供重要的理论数据支撑。另外，在药物研发方面，单细胞技术的应用将大大提高药物筛选及功能检测的成本及效率，推进现代医疗发展。
目前已有很多应用空间组学技术研究心脏发育及相关疾病的文章，您如何看待空间组学技术？您认为空间组学技术与单细胞测序技术二者的关系是怎样的？目前或未来您是否有计划进行相关技术的研究？艾珊珊教授：空间组学技术可以为生命科学研究提供一个新的视角，空间组学技术能在自然组织保持细胞正常分布的情况下捕获不同维度分子、细胞及微环境的相互作用，这是一项很棒的技术。空间组学也必然是未来生物医学研究的热点。
虽然目前为止，空间组学技术还不能达到单细胞精度，但可以将单细胞测序技术与空间组学测序技术结合，通过生物信息学的方法，还原这个细胞在空间的位置信息。当然以后在空间组学的精度进一步提升的情况下，这种数据整合的精度也会进一步得到提升，当然，我们也非常期待实验技术的进步真正能够实现单细胞水平的空间多组学测序。
目前我们也正在尝试空间ChIP-seq技术与其他技术的结合，希望在未来能有一定的突破。
单细胞测序网、时空组学网联合开展“时空对话”栏目。拟邀请100位单细胞测序领域的全球顶尖科学家、企业家、学者、投资人、青年研究员、博士等围绕着单细胞测序的最新研究、技术进展、临床应用等多方面进行访谈，传递价值观念、深度见解，为行业发展提供方向。
